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mdbioproducts常見實驗室應用程序的故障排除

更新時間：2021-06-28 點擊次數：1723

一般實驗室技術

洗滌技巧：

多通道移液器或噴瓶

確保移液器的每個尖頭都正確分配或噴射瓶有足夠的壓力。清空孔中的內容物并用指示的洗滌緩沖液體積填充孔。倒出孔，倒置并在干凈的紙巾上吸干。如插入所示重復此過程。最后一次傾析后，倒置去除任何剩余的洗滌緩沖液，并將其吸干在干凈的紙巾上。不要讓孔靜置，按照插圖中的指示進行下一步。注意：如果在傾析時條帶變得松散，則在清洗和在干凈的水槽中潷析之前對條帶進行編號非常有用。

歧管分配器或自動清洗機

確保有適當的真空供應。檢查所有插管或插腳是否正確分配和抽吸。通過抽吸或傾析清空孔。將每個孔填充到插入物中指示的適當體積。*吸出孔。去除緩沖液后，讓抽吸裝置留在孔中，不要過度抽吸孔。如插入物所示重復此過程，不要讓孔在最后一次抽吸后保持干燥。

移液技術：

確保您使用的移液器已校準，并且移液器吸頭正確且牢固地固定在移液器上。將移液器設置到所需的體積并用樣品或試劑預沖洗。緩慢向上吸取試劑，使移液器緩慢返回向上位置。稍等片刻，讓試劑在吸頭中達到體積平衡。將試劑緩慢分配到第一次停止，然后輕輕分配到第二次停止。將移液器保持在此位置，直到將其從儲液器或孔中取出，以避免將試劑吸回。當您取下移液器時，將吸頭向上拉到容器或孔的一側，以釋放可能在吸頭外側的任何液體。

ELISA 故障排除

許多因素會影響 ELISA 的性能。

在開始之前仔細閱讀說明。這將有助于避免不必要的錯誤。
使用良好的實驗室規范和校準設備。
使用干凈的容器和干凈的實驗室空間，并在每種試劑之間更換移液器吸頭。
重復運行所有標準和樣品，因為這將提高準確性。

精度差：

清洗不*：確保儀器工作正常，并且抽吸后孔看起來是干的。
試劑混合不均：確保試劑充分混合。
污染：確保使用干凈的容器并在每種試劑之間更換移液器吸頭。
移液錯誤：使用良好的實驗室技術并確保正確校準移液器。

標準曲線：

標準品制備不當：確保正確配制標準品并遵守稀釋說明。
清洗不*：確保儀器工作正常，并且抽吸后孔看起來是干的。
添加到孔中的體積不等：檢查移液器是否已校準以及移液器吸頭是否正確就位。
確保從凈 OD 中減去空白和 NSB 值。

高背景：

確保正確洗滌板。回顧上面的洗滌技術。
遵守所有孵化時間和溫度。高背景可能是由于孵育時間過長或在高于推薦溫度的情況下孵育造成的。

漂移

使用前將所有試劑置于室溫。
在運行檢測之前或按照試劑盒說明書中的指示準備試劑。
避免中斷檢測設置。

邊緣效果

在環境條件下孵育板時，請注意溫度變化或通風區域。將印版放在空調或暖氣通風口下可能會導致顏色不均勻。

色彩發展

確保所有試劑以正確的體積和正確的時間添加到檢測中。堅持正確的孵化時間。
除非試劑盒插頁中另有說明，否則在加入終止溶液后立即讀取板。
底物是否正確準備和添加

數據縮減

如需有關生成標準曲線的幫助，

IHC 故障排除

無染色

問題		可能的解決方案）
一抗和二抗可能不匹配。		建議二抗針對產生一抗的物種（例如，如果一抗是在小鼠中產生的，則使用抗小鼠二抗）。
該抗體可能不適用于以天然（非變性）形式顯示蛋白質的 IHC 程序。		在非變性和變性蛋白質印跡上測試抗體，以確保抗體識別非變性抗原。
二抗未避光保存。		建議避免將二抗暴露在光線下。
沒有足夠的一抗與目標蛋白質結合。		減少抗體稀釋。在 4°C 下孵育更長時間。
感興趣的蛋白質并不大量存在于組織中。		運行陽性對照。利用放大步驟可以幫助放大信號。使用較低稀釋度的一抗。
目標蛋白是核蛋白，抗體不能穿透細胞核。		為了促進細胞核的滲透，在封閉緩沖液和抗體稀釋緩沖液中加入透化劑。
脫蠟可能不夠		將切片脫蠟時間更長。使用新鮮制備的二甲苯。
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑可能會改變抗體識別的表位。		使用抗原修復方法揭露表位。修復時間更短。
PBS 緩沖液可能被細菌污染，這些細菌已經破壞了目標蛋白質。		在 PBS 抗體儲存緩沖液中使用防腐劑，如 0.01% 疊氮化物。使用新鮮的無菌 PBS。

高背景

問題		可能的解決方案）
非特異性結合的阻斷可能是不夠的。		將切片的封閉潛伏期延長至 30 分鐘，將細胞培養延長至 1 小時。使用封閉劑，例如 10% 正常血清用于切片，1-5% BSA 用于細胞培養。
一抗濃度可能太高。		將抗體滴定至更佳濃度，使用更多稀釋液孵育更長時間。這將提供更慢但更具體的綁定。
二抗可能非特異性結合。		在沒有一抗的情況下運行二級對照。
孵化溫度可能太高。		在 4°C 下孵育組織切片或細胞。
組織未充分洗滌。		在所有步驟之間用 PBS *清洗
內源性過氧化物酶是有活性的。		使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑太強，可能已經改變了抗體識別的表位。		改變抗原修復方法。減少抗原暴露溶液的孵育時間。
應用了過多的基材。		減少底物孵育時間。
色原與細胞中存在的 PBS 發生反應。		在與底物一起孵育之前，使用 Tris 緩沖液清洗切片。
透化已經損壞了膜并去除了膜蛋白。		從緩沖液中去除通透劑。

非特異性染色

問題		可能的解決方案）
一抗或二抗的濃度可能太高。嘗試降低抗體濃度和/或潛伏期。		將信號強度與不表達目標的細胞進行比較。
一抗是針對與染色組織相同的物種產生的（例如在大鼠組織上測試的大鼠一抗）。		當應用二抗時，它會與所有組織結合，因為它也是針對該物種產生的。使用針對與您的組織不同的物種產生的一抗/二抗。
內源性過氧化物酶是有活性的。		使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
切片/細胞已變干。		將組織切片和細胞保持在高濕度下，不要讓它們變干。

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