Cryodropper-E 80010 小鼠胚胎玻璃化說(shuō)明

小鼠胚胎玻璃化：

1.胚胎在 M2 中保存在 37°C 直到冷凍保存。

2.制作玻璃化和預(yù)玻璃化培養(yǎng)基。

3.設(shè)置便攜式 LN? 氣相冷凍機(jī)。[我們使用泡沫聚苯乙烯冷卻器并漂浮。]

4.標(biāo)記每個(gè) Cryodropper-E。[我們只對(duì)燈泡部分進(jìn)行顏色編碼或標(biāo)記。]

5.在 Cryodropper-E 燈泡中預(yù)加載 100µl 0.5M 蔗糖 M2。將 100µl 滴放在培養(yǎng)皿上，然后移液器放入 Cryodropper-E。握住 Cryodropper-E 的開(kāi)口端，輕輕將介質(zhì)輕彈到燈泡部分。輕輕擠壓燈泡以去除胚胎裝載區(qū)域中殘留的任何介質(zhì)，并用 Kimwipe 擦去液體。使用與之前相同的方法或使用凝膠加頂端輕輕定位一滴，將 <5μl 玻璃化介質(zhì)預(yù)加載到吸管區(qū)域的中心。在 Eppendorf 架子上開(kāi)放存儲(chǔ)。

6.在35mm培養(yǎng)皿的蓋子上，裝入一滴M2（每滴20-30μL）、一滴預(yù)玻璃化溶液和一滴玻璃化溶液。

7.標(biāo)記低溫儲(chǔ)存瓶并預(yù)冷。[我們使用 4 毫升冷凍管并根據(jù)需要貼上標(biāo)簽。每瓶可裝 4 個(gè) Cryodropper-E。]

8.胚胎首先被轉(zhuǎn)移到 35mm 培養(yǎng)皿中的 M2 滴。

9.用少量預(yù)玻璃化溶液預(yù)填充胚胎移液管。在解剖顯微鏡下，將胚胎從 M2 滴轉(zhuǎn)移到預(yù)玻璃化溶液滴。

10.孵育30 秒。

11.用少量玻璃化溶液預(yù)填充胚胎移液管。將胚胎從玻璃化冷凍溶液滴轉(zhuǎn)移到玻璃化冷凍溶液滴。

12.孵育30 秒。

13.收集胚胎并將它們裝入預(yù)裝在 Cryodropper-E 中的玻璃化溶液中。[它有助于將顯微鏡聚焦在移液管中的胚胎上。]

14.用熱封機(jī)在末端密封 Cryodropper-E。[輕輕測(cè)試以確保設(shè)備已密封，如果沒(méi)有，請(qǐng)?jiān)俅蚊芊狻

15. 將Cryodropper-E 放入 LN? 中，直到燈泡中的培養(yǎng)基凍結(jié)（@10 秒）。儲(chǔ)存在 LN? 蒸氣中的筏子上，直到處理完所有樣品。轉(zhuǎn)移到小瓶中。

16.然后將小瓶轉(zhuǎn)移到 LN 2 杜瓦瓶中并儲(chǔ)存在氣相中。

玻璃化小鼠胚胎的解凍：

1.為每個(gè) Cryodropper-E 準(zhǔn)備解凍盤(pán)，如下所示：一個(gè) 60mm 的蓋子，頂部有空間（M2 中 0.1 mL 的 0.5 M 蔗糖），然后每個(gè)順時(shí)針滴 20-30μl：M2 中的 0.5M 蔗糖，0.25 M2 中的 M 蔗糖和 M2（2 滴）。準(zhǔn)備孵化盤(pán)如下：60 毫米盤(pán)與 100μl KSOM 拉長(zhǎng)滴通過(guò)中心，30μl KSOM 滴在培養(yǎng)前洗滌胚胎的任一側(cè)。用石蠟覆蓋并在 37°C 下用 5% CO? 平衡至少 30 分鐘。

2.將裝有 Cryodropper-E 的小瓶從儲(chǔ)存容器中取出并保存在 LN 2 蒸氣中直至準(zhǔn)備解凍。

3.將 Cryodropper-E 浸入 37?C 的水浴中，直到滴管中的培養(yǎng)基解凍（@10 秒）。

4.切下 Cryodropper-E 的頂端，將胚胎放置在培養(yǎng)皿上。將 Cryodropper-E 球莖中的 0.5M 蔗糖 M2 輕輕向下彈到吸管上，然后從 Cryodropper-E 排出到胚胎液滴中，從而最大限度地減少氣泡。使用預(yù)裝在 M2 中的 0.5M 蔗糖的胚胎移液管立即從液滴中收集胚胎。

5.胚胎被轉(zhuǎn)移到一滴新的 0.5M 蔗糖的 M2 溶液中，然后孵育 2 分鐘。

6.使用預(yù)裝有 0.25M 蔗糖 M2 的胚胎移液管，將胚胎快速轉(zhuǎn)移到 M2 中的 0.25M 蔗糖滴中，再孵育 2 分鐘。

7.使用預(yù)裝有 M2 的胚胎移液器，將胚胎快速轉(zhuǎn)移到第一滴 M2 中并孵育 1 分鐘。

8.然后將胚胎通過(guò)最后一滴 M2，通過(guò) 2 滴 KSOM，然后轉(zhuǎn)移到油下的長(zhǎng)滴 KSOM。

9.胚胎在 37°C 和 5% CO? 條件下培養(yǎng)（桑椹胚晚期或囊胚階段培養(yǎng) 2 天）。

參考文獻(xiàn)：改編自 Wai Hung Tsang 和 King L. Chow 的 B. Stone，BioTechniques Protocol Guide 2010（第 55 頁(yè)）doi10.2144/000113258。

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

設(shè)備：

• 用于胚胎玻璃化的 Cryodropper-E（黑線：ParaTechs 80010）
• Cryovial （4 ml）或其他合適的 LN? 儲(chǔ)存選項(xiàng)（USA Scientific 1440-9100）
• 37?C 的CO? 培養(yǎng)箱
• 玻片加熱器或 37?C 培養(yǎng)箱
• 水浴@ 37°C（500 毫升燒杯水在 37°C 培養(yǎng)箱中效果很好）
• 移液器和吸頭；例如：1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 管、架
• 帶泡沫聚苯乙烯筏的便攜式 LN? 氣相冷凍機(jī)（見(jiàn)下圖）

• 用于標(biāo)記的細(xì)尖Sharpie 
• Kimwipes 
• 組織培養(yǎng)皿；35 毫米、60 毫米
• 胚胎處理移液器和口移液器
• 帶可調(diào)光源的立體顯微鏡
• 計(jì)時(shí)器
• 脈沖熱封機(jī)（美國(guó)國(guó)際電氣 AIE-105T）
• 鑷子
• 剪刀
• LN? 氣相儲(chǔ)存杜瓦瓶
• 用于滅菌的0.22 微米過(guò)濾裝置（例如： Millipore SCGVUORE 和 SLGP033RS) 
• 用于介質(zhì)存儲(chǔ)的冰箱/冰柜

所需培養(yǎng)基和試劑：

• M2培養(yǎng)基（Millipore MR-015-D）
• Ficol PM70（Sigma-Aldrich F2878）
•蔗糖（Sigma-Aldrich S1888）
•乙二醇（Sigma-Aldrich 102466）
•二甲基亞砜（DMSO）（Sigma-Aldrich D2650）
• 0.5 M 蔗糖
• FS 
• Pre-VS 
• VS 
• 0.25M 蔗糖
•石蠟油(Sigma-Aldrich 18512) 
• KSOM??培養(yǎng)基 (Millipore MR-121-D)

Cryodropper-E 80010 配方： 

PARATECHS 公司有限保修

ParaTechs 保證，在發(fā)貨時(shí)，產(chǎn)品將符合產(chǎn)品隨附的規(guī)格。本保證限制了 ParaTechs 更換產(chǎn)品的責(zé)任。  PARATECHS 對(duì)產(chǎn)品不作任何其他明示或暗示的保證；包括對(duì)任何特定用途的適銷性或適用性的任何保證，或者產(chǎn)品不會(huì)侵犯任何第三方的任何專有權(quán)利。

Cryodropper-S 80020 小鼠精z冷凍保存說(shuō)明

精z冷凍：

1.在精z冷凍保存前 4-7 天，通過(guò)交配（插頭陽(yáng)性）準(zhǔn)備 2 只雄性小鼠（>8 周齡，已證明具有生育能力）。

2.將 60μl CARD CPA 滴在 35mm 培養(yǎng)皿上，為每只小鼠準(zhǔn)備 1 個(gè)精z培養(yǎng)皿。用石蠟油覆蓋液滴。將第二個(gè) 60μl 等分的 CPA 添加到第一滴中，制成高大的半球形 CPA 滴。在 37 ?C 下平衡（不在 CO? 中）。

3.標(biāo)記每個(gè)冷凍滴管。[我們只對(duì)燈泡部分進(jìn)行顏色編碼或標(biāo)記。]

4.準(zhǔn)備 Cryodropper：在培養(yǎng)皿中制備 90μl CARD PM 培養(yǎng)基，每個(gè) Cryodropper 1 滴。在 37°C 和 5% CO? 下平衡 10 分鐘。通過(guò)移液將液滴加載到滴管中，然后輕輕地將介質(zhì)輕彈到燈泡部分。輕輕擠壓燈泡以去除精z裝載區(qū)域中殘留的任何介質(zhì)，并用 Kimwipe 擦去液體。在 37 oC 和 5% CO? 的條件下，將開(kāi)口存放在 Eppendorf 架子中，直到上樣。

5.用 LN? 設(shè)置冷凍箱并使其冷卻。

6.標(biāo)記低溫儲(chǔ)存瓶并預(yù)冷。[我們使用 4 毫升冷凍管并根據(jù)需要貼上標(biāo)簽。每個(gè)小瓶可裝 4 個(gè)冷凍滴管。]

7.對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)s。

8.去除附睪尾。將它們放在 Kimwipe 上，并在顯微鏡下*去除所有脂肪和血液。

9.將每個(gè)男性的一根附睪轉(zhuǎn)移到每個(gè)精z培養(yǎng)皿中。這使來(lái)自兩個(gè)男性的精z混合在精z盤(pán)中。注意：以下步驟必須快速執(zhí)行；從精z釋放到冷凍總共不到 30 分鐘。

10.使用制表鉗和小角度剪刀，在每個(gè)附睪至少做 6 個(gè)切口。

11.將培養(yǎng)皿放在載玻片加熱器上，以 37 oC 加熱 3 分鐘。每分鐘旋轉(zhuǎn)盤(pán)子以從組織中分散精z。當(dāng)組織從培養(yǎng)基中取出時(shí)，輕輕地從組織中擠壓剩余的精z。

12.裝載冷凍滴管：使用凝膠裝載移液器，小心地將 10μl 精z懸浮液的吸管部分裝載在中心。用熱封機(jī)密封。將加載的原型直接放在 LN2 蒸氣中的浮子上 10 分鐘。

13.將冷凍滴管轉(zhuǎn)移到小瓶中。然后將小瓶轉(zhuǎn)移到 LN 2 杜瓦瓶中并儲(chǔ)存在氣相中。

精z解凍：

1.從 LN? 存儲(chǔ)中取出 Cryodropper。

2.浸入 37°C 水浴直至解凍并孵育 10 分鐘。

3.從水浴中取出設(shè)備并用 Kimwipe 輕輕擦干。

4.用剪刀剪掉冷凍滴管的頂端，將精z滴轉(zhuǎn)移到新鮮的試管嬰兒培養(yǎng)皿中。

5.輕輕晃動(dòng)手腕，輕輕搖動(dòng) CARD PM 介質(zhì)至設(shè)備末端。[用力過(guò)猛，介質(zhì)會(huì)丟失。]

6.在精z滴上涂抹培養(yǎng)基。[注意：如果使用試管嬰兒培養(yǎng)皿，則應(yīng)通過(guò)外腔中的水保持濕度。如果使用普通的培養(yǎng)皿，精z滴應(yīng)該在精z解凍前用在 CO? 培養(yǎng)箱中平衡的石蠟覆蓋至少 30 分鐘。]

7.在 CO? 培養(yǎng)箱中在 37 oC 下培養(yǎng)以使其容量化。[我們通常需要大約 45 分鐘。]

參考資料：

改編自 Behringer R、Gertsenstein M、Vintersten K、Nagy A. 的 B. Stone，2014 年。操縱小鼠胚胎：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第 4 版。冷泉港（紐約）：冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社。

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

所需媒體：

• 石蠟油，(Sigma-Aldrich 18512) 
• FERTIUP 冷凍保護(hù)劑 (CPA) (Cosmobio KYD-001)（也可以內(nèi)部制造，Behringer 等人，第 674-675 頁(yè)）
• FERTIUP 預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 (PM)（Cosmobio KYD-002）（也可以在內(nèi)部制造，Behringer 等人，第 614 頁(yè)）

設(shè)備：

• 用于精z玻璃化的
冷凍滴管（紅線：ParaTechs 80020）• 冷凍管（4 ml）或其他合適的 LN2 儲(chǔ)存選項(xiàng)（USA Scientific 1440-9100）
• 37 ?C 的 CO? 培養(yǎng)箱 • 玻片
加熱器或 37 ?C 培養(yǎng)箱
• 水浴 @ 37 ? C （在 37°C 培養(yǎng)箱中加入 500 毫升燒杯水效果很好）
• 凝膠加載
吸頭（例如：USA Scientific 1022-0600）• 移液器和吸頭；例如：1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 架
• 帶泡沫聚苯乙烯筏的便攜式 LN? 氣相冷凍機(jī)（見(jiàn)下圖）

• 用于標(biāo)記的Sharpie 
• Kimwipes 
• 組織培養(yǎng)皿；35 毫米，IVF 培養(yǎng)皿（可選）
• 立體顯微鏡
• 計(jì)時(shí)器
• 脈沖熱封機(jī)（美國(guó)國(guó)際電氣 AIE-105T）
• 鑷子（制表師 #5）
• 剪刀，解剖和小角度
• LN2 氣相儲(chǔ)存杜瓦瓶

動(dòng)物：

• 用于精z采集的雄性小鼠（證明生育能力，采集前 4-7 天交配）