磷酸化特異性抗體的發明*改變了我們研究蛋白質功能的方式

由 Mike Browning 和 Amy Archuleta 提供

對于蛋白質，形成 IS 函數。

蛋白質做它們做的事是因為它們的形狀。結構蛋白不斷發揮作用以支撐細胞結構。其他蛋白質介導的生物功能（例如細胞分裂）必須根據細胞需要進行調節和關閉。蛋白質磷酸化是調節蛋白質結構及其活性的主要細胞機制。當蛋白激酶將磷酸從 ATP 轉移到目標蛋白上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基時，就會發生蛋白磷酸化。添加帶負電荷的磷酸基團會改變目標蛋白質的形狀，從而改變其功能。

磷蛋白被認為是體內最重要的蛋白質之一。

磷蛋白是調節幾乎所有細胞過程的蛋白質，從癌癥中的細胞分裂到學習和記憶中的神經元信號轉導。由于磷蛋白幾乎調節所有重要的細胞功能，我們喜歡說“磷蛋白是蛋白質組學語言的動詞”。分析特定蛋白質磷酸化狀態的能力對于確定給定蛋白質的功能以及該活性如何受細胞信號影響的探索非常有用。此類檢測對于鑒定可影響磷酸化并因此影響特定蛋白質功能的藥物也至關重要。

需要一種方法來跟蹤蛋白質的活性，而不僅僅是其表達水平。

為了形象化這種工具的重要性，想象一個 FBI 特工坐在車里監視房子里的嫌疑R。特工可能無法看到嫌疑R在哪個房間或他們在做什么。將其與房屋內裝有攝像機的代理進行對比。同樣，磷酸化特異性抗體不僅表明存在蛋白質，還表明蛋白質是否具有活性。

磷蛋白檢測的歷史始于放射性。

不幸的是，在早期研究中可視化磷蛋白需要用32 P對磷酸基團進行放射性標記。 這是勞動密集型的：實際上有數千種蛋白質被磷酸化（并結合32 P），因此需要免疫沉淀將感興趣的蛋白質與所有其他標記的蛋白質分開蛋白質。然而，即使進行免疫沉淀并分離出感興趣的蛋白質，也無法確定蛋白質上的哪個位點已被磷酸化。這是至關重要的，因為蛋白質上的某些位點可以打開它，而其他位點可以關閉它。此外，32 P 研究很難量化，因為僅代謝變化就可以改變32P 級別的標記。最后，由于無法在體內用32 P標記，體內磷酸化的研究實際上是不可能的。

幾十年前，磷酸化特異性抗體的開發始于針對磷酸酪氨酸的抗體。

產生磷酸化依賴性抗體的第一份報告出現在 1981 年，當時通過將膦酸芐酯注射到兔子體內產生了可以檢測含磷酸酪氨酸蛋白的抗體 (1)。這些抗體成為癌癥研究的關鍵試劑，但在許多蛋白質上檢測到磷酸酪氨酸。此類抗體的主要缺點不僅在于它們檢測許多不同蛋白質的磷酸化，而且與32P 研究，他們經常檢測同一蛋白質上的多個磷酸化位點。本質上，此類抗體顯示磷酸化正在發生，但無法識別哪些蛋白質以及蛋白質上的哪些位點被磷酸化。還進行了許多嘗試以產生檢測磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的抗體，但這些方法大體上不是很成功。

使用全長蛋白質作為抗原更有針對性，但仍然存在問題。

在這項初步工作后不久，Nairn 及其同事描述了一種特異性針對 G 底物磷酸化形式的抗體的產生，G 底物是一種定位于小腦浦肯野細胞并被 cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化的蛋白質 (2)。該抗體是通過體外磷酸化的純化G-底物磷蛋白對家兔進行免疫接種而制備的。. 盡管取得了初步成功，但通過用完整蛋白質的磷酸形式免疫來生產磷酸特異性抗血清的其他嘗試并不十分成功，這可能是因為兩個重要因素。首先，據信許多磷酸化蛋白質在免疫過程中會快速去磷酸化，無論注射途徑如何，都會導致所需磷酸化表位的丟失。其次，全蛋白通常含有多個免疫原性表位。由于磷酸位點只是這種長蛋白質的一小段，因此針對全長蛋白質抗原的抗體識別感興趣的磷酸位點的可能性很低。

生成位點特異性磷酸化抗體的更直接方法是利用合成肽的磷酸化形式。

由緊鄰感興趣的磷酸化氨基酸周圍的 15-20 個氨基酸組成的短肽將免疫反應集中在特定磷酸位點上。此外，這些短肽通常對去磷酸化具有抗性。然而，這不是絕對的，因為某些肽確實會去磷酸化。這也導致產生針對非磷酸化肽的抗體。因此，必須純化這些肽免疫后收集的血清，以將磷酸肽抗體與識別 dephopsho 肽的抗體分離。

磷酸化和去磷酸化肽在磷酸化特異性抗體的純化中非常有用。

我們的一位聯合創始人：Andy Czernik 和他的同事 (3) 制定了生產磷酸化狀態特異性抗體的通用方案。通過連續層析，首先通過將血清通過與用作抗原的磷酸化肽結合的柱子，從去磷酸化抗體中積極地選擇磷酸化抗體。此步驟之后是在與去磷酸化形式的肽結合的柱上進行負選擇。可以在我們的網站上找到此純化程序的詳細信息。

今天的磷酸化特異性抗體僅在蛋白質處于磷酸化狀態時與目標蛋白質結合。

通過這種革命性免疫化學技術的發展，現在可以開發磷酸化特異性抗體，用于確定特定蛋白質上特定位點的磷酸化水平。它們更容易使用，因為抗體只標記感興趣的蛋白質。IP 不需要分離其他蛋白質，也不需要使用32 P 標記。因此，抗體可用于 WB 和 IHC，以顯示目標蛋白特定位點磷酸化的相對強度。此外，當該抗體用于 IHC 時，可以識別其中蛋白質已被激活的特定細胞。我們將在我們的博客中討論在 IHC 中使用磷酸化特異性抗體。

對磷蛋白功能的了解導致了癌癥治療的巨大進步。

磷酸化特異性抗體*改變了蛋白質磷酸化的研究，并幫助了許多針對磷蛋白治療疾病狀態的新藥的開發。影響磷酸化的藥物在癌癥治療中得到*泛的應用和研究。最常見的磷酸化相關藥物是小分子激酶抑制劑。此類抑制劑占當前藥物發現和開發工作的近四分之一。抑制不同的激酶信號通路對非癌細胞的細胞毒性較小，從而影響對癌細胞的選擇性殺傷，毒性較小 (4)。

超越蛋白質印跡：IHC 和 IF 的未開發機會。

磷酸化特異性抗體廣泛用于磷酸化蛋白的蛋白質印跡分析。然而，在免疫組織化學的奇妙世界中，這些抗體的使用卻少得多。鑒于此類研究可以提供有關磷蛋白的細胞和亞細胞定位的明顯細節，因此缺乏使用 IHC/IF 的研究是不幸的。在 PhosphoSolutions，我們竭盡全力驗證我們的許多 IHC/IF 磷酸化抗體。此外，我們還寫了一章討論這些抗體在 IHC/IF 中的使用。在隨后的博客中，我們將討論在 IHC/IF 中使用磷酸化抗體的最佳實踐。

來自我們創始人 Mike Browning 的最后個人筆記

多年前我開始讀研究生時，只知道 2 種蛋白激酶。今天我們知道人類基因組編碼超過 500 種激酶。盡管如此，發現這個迷人的世界還是非常令人興奮的，在這個世界中，蛋白質可以像燈泡一樣被關閉和重新打開。當我得知這個過程時，就像一個燈泡在我腦海中閃過。我正在研究腦細胞信號的可塑性方式，即它可以打開和關閉，甚至可以像立體聲音響上的音量控制一樣上下。就在我面前的是支持大腦可塑性的分子機制：塑料蛋白！我被迷住了，從那以后一直如此。謝天謝地，有磷酸抗體，否則我現在可能會對32 P產生放射性。