一個抗體做IHC染色，如果不出效果，可能是哪些因素造成的？

一個抗體在免疫組化（IHC）實驗中不出效果（即無信號或信號弱）是一個非常常見的問題。這通常是由一整套復(fù)雜的因素共同導(dǎo)致的，需要進(jìn)行系統(tǒng)性的排查。

以下是可能導(dǎo)致IHC染色失敗的常見原因，可以按照這個思路進(jìn)行排查： 

一、 樣本相關(guān)問題

1.  固定不當(dāng)：

●固定不及時：組織離體后未及時固定，導(dǎo)致抗原降解（內(nèi)部蛋白酶分解）或彌散。

●固定時間過長或過短：

- 過短：固定不充分，抗原保存不佳。

- 過長：過度交聯(lián)會遮蔽抗原表位，尤其是甲醛固定，導(dǎo)致抗原無法被抗體識別。這種情況非常常見。

●固定劑不匹配：常用的是10%中性福爾林，但某些特定抗原可能需要特殊的固定液（如丙酮、乙醇等）。

2.  包埋與切片：

●烤片溫度過高或時間過長：會破壞抗原。

●切片厚度：切片太厚可能導(dǎo)致抗體滲透不佳，背景加深；太薄可能導(dǎo)致目標(biāo)抗原量不足。

3.  內(nèi)源性干擾物質(zhì)：

●內(nèi)源性過氧化物酶：在肝臟、腎臟等富含血細(xì)胞的組織中，未全部滅活的內(nèi)源性過氧化物酶會導(dǎo)致背景染色，掩蓋特異性信號。

●內(nèi)源性生物素：在某些組織（如肝、腎、腦）中含量高，如果使用生物素檢測系統(tǒng)，會產(chǎn)生嚴(yán)重的非特異性背景。

4.  抗原修復(fù)不當(dāng)（這是最常見的原因之一）

●未進(jìn)行抗原修復(fù)：對于福爾林固定石蠟包埋的組織，絕大多數(shù)抗原都被交聯(lián)遮蔽，必須進(jìn)行抗原修復(fù)。

●修復(fù)方法選擇錯誤：

- 熱修復(fù)法：包括高壓法、微波法、水浴法。適用于大多數(shù)抗原。

- 酶修復(fù)法：如胰蛋白酶、胃蛋白酶。適用于特定抗原。

- 選擇錯誤的修復(fù)方法或修復(fù)液（如該用EDTA修復(fù)液卻用了枸櫞酸鹽修復(fù)液）可能導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。

●修復(fù)條件不佳：修復(fù)時間、溫度、pH值不準(zhǔn)確。修復(fù)不足會導(dǎo)致信號弱；修復(fù)過度可能導(dǎo)致背景染色或組織脫片。

 二、 抗體相關(guān)問題

1.  抗體選擇不當(dāng)：

●抗體特異性：抗體并非為其應(yīng)用（IHC）而驗證。務(wù)必查閱說明書，確認(rèn)該抗體已驗證可用于IHC，特別是您所用的物種和組織類型（如：人、小鼠、大鼠；石蠟切片/冰凍切片）。

●抗體克隆號：不同克隆號識別同一蛋白的不同表位，其IHC效果可能差異巨大。

2.  抗體保存與使用：

●抗體失效：抗體反復(fù)凍融、存放溫度不當(dāng)或超過有效期導(dǎo)致失活。

●稀釋度不當(dāng)：

- 濃度過低：信號弱或無信號。

- 濃度過高：可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合，背景高，信噪比差。

●孵育條件：孵育時間不足或溫度過低，抗體未能充分與抗原結(jié)合。

 三、 實驗操作與試劑問題

1.  檢測系統(tǒng)問題：

●檢測試劑盒失效：HRP或AP酶失活，或顯色底物失效（例如DAB/AEC沉淀）。

●系統(tǒng)不匹配：使用了一抗種屬不匹配的二抗（如兔來源的一抗用了抗小鼠的二抗）。

●步驟遺漏或錯誤：例如忘了加二抗，或忘了加顯色底物。

2.  封閉問題：

●封閉不充分：導(dǎo)致非特異性背景高，可能掩蓋弱陽性信號。

●封閉劑選擇不當(dāng)：常用5% BSA或與二抗同源的非免疫血清。如果使用生物素系統(tǒng)，需要額外進(jìn)行內(nèi)源性生物素封閉。

3.  洗滌問題：

●洗滌不充分：殘留的抗體或試劑會導(dǎo)致高背景。

●洗滌過度：可能會洗掉特異性結(jié)合的一抗/二抗。

4.  顯色與復(fù)染：

●顯色時間過短：信號未充分顯現(xiàn)。

●顯色時間過長：背景過高，甚至出現(xiàn)假陽性。

●復(fù)染過深：掩蓋了弱陽性信號。

 四、 對照設(shè)置問題

沒有設(shè)置正確的對照，就無法判斷問題是出在樣本、抗體還是操作上。

●陽性對照：使用已知表達(dá)該靶抗原的組織。如果陽性對照也無染色，說明整個實驗系統(tǒng)有問題。

●陰性對照：

- 空白對照：只用PBS或抗體稀釋液代替一抗。如果此對照有染色，說明存在非特異性背景。

- 同型對照：使用與一抗同種屬、同亞型的無關(guān)免疫球蛋白。用于排除抗體的Fc段非特異性結(jié)合。

五、系統(tǒng)性排查建議（故障排除流程）

當(dāng)遇到無信號時，建議按以下步驟排查：

1.  確認(rèn)陽性對照：您的陽性對照組織染色是否正常？

●是 → 問題很可能在您的“待測樣本"本身（抗原不表達(dá)或含量極低）或“樣本處理"（固定、包埋）上。

●否 → 問題出在“實驗流程或試劑"上。

2.  檢查陰性對照：您的陰性對照（無一抗）是否有染色？

●是 → 存在“高背景"。檢查：內(nèi)源性酶是否全部滅活？封閉是否充分？抗體濃度是否過高？洗滌是否充分？

●否 → 背景干凈，但無信號，進(jìn)入下一步。

3.  回顧實驗流程：

●抗原修復(fù)：這是石蠟切片的首要排查點。嘗試更換修復(fù)方法（如從枸櫞酸鹽換為EDTA）或優(yōu)化修復(fù)條件（時間、溫度）。

●抗體：重新查閱說明書，確認(rèn)稀釋比、孵育時間和條件。使用更新鮮的抗體或新批次抗體進(jìn)行測試。

●檢測系統(tǒng)：確認(rèn)所有試劑（特別是二抗和DAB）均在有效期內(nèi)，且正確配制。嘗試使用敏感性更高的檢測系統(tǒng)（如聚合物法）。

4.  最終驗證：

●如果條件允許，可以使用“Western Blot"驗證該樣本中是否存在目標(biāo)蛋白。

●嘗試使用另一種“已驗證有效的、不同克隆號"的抗體來檢測同一靶點。

六、總結(jié)

總之，IHC是一個多步驟的復(fù)雜實驗，需要精細(xì)的操作和系統(tǒng)性的優(yōu)化。從樣本處理開始，每一步都可能成為成敗的關(guān)鍵。

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